Western Blot实验报告
一、实验器材及试剂
二、Western Blot实验步骤
1、细胞总蛋白提取
1.1对于悬浮细胞: 2000rpm，4℃，5 min，离心收集细胞沉淀，每106细胞加250 ul左右RIPA裂解液（在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。如果需要提高蛋白浓度，可适当减少裂解液使用量。
1.2对于贴壁细胞:
1.2.1用PBS冲洗细胞2-3次，*后一次清洗完，倒掉pbs，用移液器尽量吸干残留液体；
1.2.2加入适当体积的 RIPA裂解液（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）于培养板/培养瓶内3-5min。期间反复晃动培养板/瓶，使试剂与细胞充分接触；
1.2.3用细胞刮刀将细胞刮下，转移到1.5ml离心管中；
1.3冰上裂解30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
1.412000rpm,4℃，离心10min，收集上清，即为总蛋白溶液。
2、组织总蛋白提取：
2.1组织块用预冷的PBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆管中，加入1~2个3mm的匀浆珠，加入10倍组织体积的裂解液（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），设置匀浆程序进行匀浆；如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少裂解液体积；
2.2将匀浆完成的匀浆管取出，放置冰上裂解液30min，每隔5min震荡一次确保组织完全裂解；
2.312000rpm，4℃，离心10min，收集上清，即为总蛋白溶液。
3、浆蛋白核蛋白提取（细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒）
3.5每20微升细胞沉淀加入200微升添加了PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂A；)
3.6*高速剧烈Vortex 5秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开；(如果细胞沉淀没有完全悬浮并分散开，可以适当延长vortex时间。)
3.7冰浴10-15分钟；
3.8加入细胞浆蛋白抽提试剂B 10微升。*高速剧烈Vortex 5秒，冰浴1分钟；
3.9*高速剧烈Vortex 5秒，4℃ 12,000-16,000g离心5分钟；
3.10立即吸取上清至一预冷的EP管中，即为抽提得到的细胞浆蛋白。可以立即使用，也可以冻存；
3.11对于沉淀，完全吸尽残余的上清，加入50微升添加了PMSF的细胞核蛋白抽提试剂；
3.12*高速剧烈Vortex 15-30秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。然后放回冰浴中，每隔1-2分钟再高速剧烈Vortex 15-30秒，共30分钟；
3.134℃ 12,000-16,000g离心10分钟；
3.14立即吸取上清至一预冷的EP管中，即为抽提得到的细胞核蛋白。可以立即使用，也可以-80℃冻存；
454、蛋白浓度测定：如果需要测蛋白浓度，取未变性的蛋白溶液 |
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